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HE染色實驗中常見問題及應(yīng)對措施

 更新時間:2023-04-25 點擊量:974
HE染色實驗常見問題及解決方案
    HE染色是石蠟切片技術(shù)中常用的染色方法之一,簡稱為蘇木精-伊紅染色法。該方法使用堿性的蘇木精染液將細胞核內(nèi)的染色質(zhì)和胞質(zhì)內(nèi)的核酸染成紫藍色,同時使用酸性染料伊紅將細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)中的成分染成紅色。
 
1、切片出現(xiàn)白色斑點
原因:(1) 烘片溫度過低,導(dǎo)致玻片未干透;(2) 切片在二甲苯中停留時間過短;(3) 二甲苯使用時間過長,導(dǎo)致脫蠟不效果不好。
對策:若玻片未干透,先用無水乙醇去除水分,再重新脫蠟。若斑點是由于停留時間過短或使用時間過長造成的,則需重新操作,延長停留時間或更換二甲苯。
 
2、細胞核染色暗淡
原因:(1) 切片在蘇木精染色液中停留時間太短;(2) 蘇木精染色液過度氧化;(3) 分化步驟時間過長;(4) 骨組織脫鈣過度。
對策:重新染色,若固定時間過長導(dǎo)致染色能力減弱,需延長蘇木精染色液停留時間或采用增加組織嗜堿性的方法。
 
3、細胞核過染
原因:(1) 切片在蘇木精染色液中停留時間過長;(2) 切片過厚;(3) 分化步驟時間過短。
對策:若非切片過厚導(dǎo)致,重新染色并適當(dāng)調(diào)整染色和分化時間。若是切片過厚,需重新切片。
 
4、細胞核呈紅、棕色改變
原因:蘇木精染色液過度氧化或切片返藍不足。
對策:檢查蘇木精染色液的染色能力,及時更換過度氧化的液體。在蘇木精染色后,用流水、溫水或弱堿性溶液如稀氨水、0.2%碳酸氫鈉等進行足夠的藍化處理。
5、伊紅著色淡
原因:(1)伊紅染液的pH值可能大于5;(2)藍化液殘留過多;(3)切片太??;(4)切片經(jīng)伊紅染色后在乙醇脫水時間過長。
對策:檢查伊紅染液的pH值,如果必要的話,用乙酸將其調(diào)節(jié)在4~5之間,從而使伊紅染色色彩艷麗。確保每次藍化步驟完成后,使用的弱堿性溶液被充分洗去,玻片上沒有殘留的弱堿性溶液。檢查切片的厚度。脫水時不要讓切片在低濃度乙醇停留時間過長,因為含水多的低濃度乙醇會將伊紅的顏色分化掉。

6、細胞質(zhì)過染
原因:(1)伊紅染色液濃度太高,特別是焰紅燃料、四溴四氯熒光素鈉的存在;(2)切片在伊紅染色時間過長;(3)切片在伊紅染色后經(jīng)乙醇脫水步驟時過的太快,而使乙醇分化伊紅的作用不能產(chǎn)生。
對策:適當(dāng)稀釋伊紅染色液,減少伊紅染色時間,或者使切片在乙醇脫水等步驟時,停留時間相對均勻。同樣,也要檢查切片的厚度是否合適。

7、切片中出現(xiàn)藍黑色沉淀物
原因:蘇木精染色液中的金屬膜,黏附在玻片上。
對策:每天染色前仔細過濾蘇木精染色液,或建議使用半氧化蘇木精染色液,如Gill蘇木精染色液,可以避免過多的金屬膜產(chǎn)生。

8、顯微鏡下見切片內(nèi)有大量水珠
原因:切片經(jīng)梯度乙醇處理后沒有脫水,導(dǎo)致二甲苯透明中性樹膠封固后殘留大量水分。
對策:移去蓋玻片,用二甲苯溶解封固劑如中性樹膠。將切片置入新鮮的無水乙醇中,待切片重新脫水后,用新二甲苯透明,中性樹膠封固。所有用于脫水和透明的液體,在使用一定時間以后,應(yīng)即時更換。

染色液.jpg


9、光鏡下切片某些區(qū)域難以聚焦
原因:蓋玻片上可能有封固切片的封固劑。
對策:移去蓋玻片,重新用干凈的蓋玻片封片。

10、封固劑從蓋玻片與載玻片之間的縫隙回縮
原因:(1)蓋玻片彎曲或不平整;(2)封固劑含二甲苯過多,稀釋過度。
對策:移去蓋玻片,重新找一張蓋玻片,用干凈的封固劑封片。每天保證盛裝封固劑的容器密封性良好,在封固結(jié)束的時候蓋緊蓋子。盡量使用小的容器盛裝封固劑,一旦封固劑太粘稠,就可以廢棄不再使用。

11、切片從脫蠟的二甲苯經(jīng)過梯度乙醇進入水溶液時,水和玻片呈現(xiàn)乳白色混濁改變
原因:用于脫蠟的二甲苯?jīng)]有被乙醇洗干凈。
對策:更換洗滌二甲苯的乙醇液體,把切片重新放回?zé)o水乙醇,脫去玻片上的水分。

12、細胞核灰藍
原因:(1)組織處理溫度過高、過熱,在石蠟停留的時間過長;(2)固定時間太短,接下來就直接在高濃度的乙醇中行脫水處理。
對策:理論上來說,加熱處理僅在組織浸蠟步驟才使用,組織不能在熱的蠟液中停留過長時間。如果由于某些原因不能進行下步包埋處理,完成浸蠟處理后的組織,可將組織連同塑料包埋盒一并放置在室溫空氣中,冷卻凝固,以備包埋。待需要包埋時再重新加溫直至石蠟融化即可。組織在處理前必須確保固定良好,脫水最好能從低濃度的乙醇開始。

13、切片中出現(xiàn)類似色素樣的點狀結(jié)晶和黑色光滑的細胞核
原因:切片封片前放置在空氣中時間太長,以至于二甲苯揮發(fā)切片干燥所致。
對策:移去組織切片上的蓋玻片和封固劑,重新處理。將切片水洗數(shù)分鐘,然后重新脫水、透明、封固。封片過程中要保持組織切片的輕度濕潤,盡量不要讓其干燥。
 
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