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穩(wěn)定細胞株的篩選步驟

 更新時間:2023-04-24 點擊量:938

穩(wěn)定細胞株是一種常用于基因表達、藥物篩選和蛋白質(zhì)表達等領(lǐng)域的工具。但是,穩(wěn)定細胞株的篩選需要經(jīng)過一系列的步驟和實驗,下面介紹一下穩(wěn)定細胞株篩選的兩種方法和穩(wěn)定細胞株的篩選簡要步驟:
一、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法
先把質(zhì)粒整合到染色體上后,用相應(yīng)的質(zhì)粒DNA中的抗性標志來篩選該細胞系,單克隆篩選穩(wěn)定細胞株。
1、篩選濃度測定,以10~14 天細胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度;
2、進行細胞接種,轉(zhuǎn)染實驗前天接種細胞,各種細胞的平板密度依據(jù)各種細胞的生長率和細胞形狀而定。進行轉(zhuǎn)染當天細胞密度應(yīng)達到60%~80% 覆蓋;
3、進行細胞轉(zhuǎn)染
4、利用質(zhì)粒上含有的抗性選擇進行篩選,并鑒定篩選結(jié)果。
 
二、慢病毒轉(zhuǎn)染法:
應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒,慢病毒轉(zhuǎn)染,篩選穩(wěn)定細胞株。慢病毒可以攜帶外源基因隨機整合進基因組。轉(zhuǎn)染得到穩(wěn)定細胞株的效率高,是建立穩(wěn)定株的比較不錯的方式。
1、將人源化的抗體基因轉(zhuǎn)接到慢病毒載體上,
2、使用包裝細胞,一般為293細胞,包裝出病毒,不同類型病毒包裝時間一般在3-5天。 
3、用病毒轉(zhuǎn)染目的細胞。包裝好的病毒要先測滴度,根據(jù)滴度決定轉(zhuǎn)染目的細胞的病毒量。
4、后期篩選。轉(zhuǎn)染目的細胞1-2天后加抗生素篩選得到穩(wěn)定細胞株。

293t細胞.jpg

 
穩(wěn)定細胞株篩選步驟:
1.構(gòu)建攜帶目標基因的載體
首先,需要將目標基因克隆到攜帶有選擇標記的載體中,例如含有抗生素抗性基因的質(zhì)粒。然后將該載體轉(zhuǎn)染到目標細胞中。
 
2.選擇標記篩選
轉(zhuǎn)染后的細胞需要在含有抗生素的培養(yǎng)基中進行篩選。只有成功轉(zhuǎn)染的細胞才能夠在含有抗生素的培養(yǎng)基中生長。
 
3.穩(wěn)定細胞株的篩選
在完成了選擇標記篩選后,需要對細胞進行進一步的篩選,以得到穩(wěn)定的細胞株。這可以通過對細胞進行單克隆分離來實現(xiàn)。具體地,將轉(zhuǎn)染后的細胞在96孔板中進行單克隆分離,每個孔只保留一個細胞。然后,通過檢測細胞株的表達水平和穩(wěn)定性,篩選出較佳的穩(wěn)定細胞株。
 
總結(jié):
穩(wěn)定細胞株的篩選是一個復(fù)雜的過程,需要仔細設(shè)計和實驗。通過上述步驟,可以篩選出高表達、穩(wěn)定的細胞株,為后續(xù)的實驗和研究提供了有力的支持。
 
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