實時定量PCR技術(shù)中常見問題匯總
實時定量PCR技術(shù)(real-time PCR)也叫qPCR(Quantitave PCR),是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程,最后通過特定數(shù)學原理對未知模板進行定量分析的方法。它是一項臨床上非常成熟的技術(shù),目前在分子生物學領(lǐng)域,qPCR核酸定量的主要方法。目前仍在全球肆虐的病毒鑒定的“金標準"——核酸檢測就是通過qPCR原理進行的。
那么拿到一個樣本,需要經(jīng)過以下多項操作流程才能定量檢測到它的核酸含量。其中任何一個步驟操作失誤都會導致它的檢測結(jié)果出現(xiàn)異常!
1、無Ct值出現(xiàn)
a) 檢測熒光信號的步驟有誤:一般染料法采用72℃延伸時采集,探針法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號。
b) 引物或探針降解:可通過PAGE電泳檢測其完整性。
c) 模板量不足:對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
d) 模板降解:避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復凍融的情況。
e) 反應循環(huán)數(shù)不夠:一般都要在35個循環(huán)以上,可根據(jù)實驗情況增加循環(huán),但高于45個循環(huán)會增加過多的背景信號。
2、Ct值出現(xiàn)過晚
a) 擴增效率極低:優(yōu)化反應條件,嘗試三步法擴增程序,或者重新設(shè)計引物。
b) 模板濃度太低:減少稀釋度,重復實驗。
c) 模板降解:重新制備模板,重復實驗。
d) PCR產(chǎn)物太長:一般將PCR產(chǎn)物長度設(shè)計為100 bp-200 bp之間。
e) 反應體系中存在PCR反應抑制劑:一般為加入模板時帶入,導致模板質(zhì)量不高,加大模板稀釋倍數(shù)或者重新制備模板重復實驗。
3、陰性對照出現(xiàn)明顯擴增
a) 反應體系組分(如水)被污染:實驗過程中,更換新的Mix或者水重復實驗。
b) 標本間的交叉污染或產(chǎn)物污染:反應體系在超凈工作臺內(nèi)配制,對實驗室進行嚴格的區(qū)分,減少氣溶膠污染;使用帶濾芯的槍頭。
c) 引物二聚體的出現(xiàn):引物設(shè)計不夠優(yōu)化:應避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。
d) 引物濃度不佳:適當降低引物的濃度,并注意上下游引物的濃度配比。在35循環(huán)后陰性對照出現(xiàn)擴增屬正常情況,可配合熔解曲線進行分析。
4、熔解曲線出現(xiàn)多峰
a) 非特異性擴增。
b) 引物設(shè)計不佳:避免二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。
c) 引物濃度不佳:適當調(diào)整引物濃度。
d) 退火溫度低:提高退火溫度。
e) 模板中有基因組DNA的污染:RNA提取過程中避免基因組DNA的污染(DNaseI處理),或通過設(shè)計引物避免非特異性擴增。
5、出現(xiàn)引物二聚體
a) 優(yōu)化擴增條件,如提高退火溫度,可利用梯度PCR,摸索最佳的Tm值。通常兩步循環(huán)(由95℃變性步驟直接進入60℃退火和延伸步驟)有利于強效擴增,因此引物設(shè)計時設(shè)定的成功退火溫度為60°C。
b) 引物濃度太高,適當降低引物濃度。
c) 可通過瓊脂糖凝膠電泳確認引物二聚體。引物二聚體在凝膠的底部形成擴散條帶,通常位于100 bp以下。
6、擴增效率低
a) 反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。
b) 反應條件不佳:適當降低退火溫度或改為三步擴增法。
c) 反應體系中有抑制物:一般為模板中引入,應先把模板適當稀釋,再加入到體系中,減少抑制物的影響。
7、實驗重復性差
a) 加樣體積失準:使用性能較好的移液槍,擴大反應體積,將模板做高倍稀釋,以大體積加入反應體系中。
b) 定量PCR儀不同位置溫度控制不一致:定期校準儀器。
c) 模板濃度太低:模板濃度越稀,重復性越差,減少模板稀釋度或提高加樣體積。
d) qPCR mix沒有混勻,請使用前充分混勻。
蘇州阿爾法生物提供的PCR儀系列主要有A100基因擴增儀、A200PCR儀、A300快速PCR儀、A600梯度PCR儀、T20PCR儀、Q2000B高通量熒光定量PCR儀、便攜式PCR儀等。