Trizol試劑的使用方法

該法從細(xì)胞中提取RNA--用勻漿器將組織磨碎，加入TRIzol處理組織。5分鐘后加入氯仿，以每分鐘12000轉(zhuǎn)離心5分鐘，樣品即分成水樣層、中間層和有機(jī)層。

※RNA存在于水樣層中，收集水樣層后可以通過異丙醇沉淀RNA來還原。

※在除去水樣層后，中間層中的DNA和蛋白質(zhì)也能相繼以沉淀的方式還原:乙醇能使中間層的DNA沉淀析出，在中間層中加入異丙醇能沉淀出蛋白質(zhì)。

每100ml TRIzol可以抽提100個(gè)六孔板中的樣品或100個(gè)50-80mg的組織樣品。無論樣品是人、動(dòng)物、植物還是細(xì)菌組織，該方法對少量的組織(50-100mg)和細(xì)胞(約五百萬個(gè))及大量的組織(≥1g)和細(xì)胞(超過一千萬個(gè))均有較好的分離效果。

每一百萬細(xì)胞用TRIzol抽提可得5-15微克RNA，每毫克組織用TRIzol抽提可得1-10微克RNA(產(chǎn)量因細(xì)胞和組織不同而異)。

TRIzol操作上的簡便性允許其同時(shí)處理多個(gè)樣品，所有的操作可以在一小時(shí)內(nèi)完成。

TRIzol抽提的總RNA能夠避免DNA和蛋白質(zhì)的污染，故而能夠作RNA 印跡分析、斑點(diǎn)雜交、poly(A)+ 選擇、體外翻譯、RNA酶保護(hù)分析和單分子克隆(PCR)。

※如果是用于PCR，當(dāng)兩條引物位于單一外顯子內(nèi)時(shí)，建議用級聯(lián)擴(kuò)大的DNase I(Cat. No. 18068)來處理抽提的總RNA。

※TRIzol試劑能促進(jìn)不同種屬、不同分子量大小的多種RNA的析出。例如，從大鼠肝臟抽提的RNA經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙啶染色，可見許多介于7kb和15kb之間的不連續(xù)的高分子量條帶(mRNA和hnRNA成分)，兩條優(yōu)勢核糖體RNA條帶位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1和0.3kb之間 (tRNA,5S)。當(dāng)抽提的RNA用TE稀釋時(shí)，其A260/A280比值≥1.8。抽提小RNA時(shí)宜-70℃沉淀過夜。

TRIzol對人體有害，使用時(shí)應(yīng)戴一次性手套，注意防止濺出。

⒈樣品的制備 當(dāng)樣品富含蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或是細(xì)胞外物質(zhì)例如肌肉，脂肪組織和植物的塊莖部分時(shí)可能需要一額外的分離步驟。勻漿化后在2-8°C的條件下以12,000×g的離心力離心10分鐘，移除勻漿中不溶解的物質(zhì)，余下的沉淀中包含有細(xì)胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，而上層的超浮游物含有RNA。在來自于脂肪組織的樣品中，大量的脂肪漂在最上層因而應(yīng)該除掉。在每一個(gè)個(gè)案中，將清亮的勻漿溶液轉(zhuǎn)移到一干凈的試管中加入氯仿并繼續(xù)進(jìn)行下述的分離步驟。

⒉ 分離階段 將勻漿樣品在15-30°C條件下孵育5分鐘以使核蛋白體分解。每1 ml TRIZOL加0.2 ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15秒并將其在30°C下孵育2-3分鐘。在2-8°C下以不超過12,000×g的離心力高速冷凍離心15分鐘。離心后混合物分成三層:下層紅色的苯酚-氯仿層，中間層，上層無色的水樣層。RNA無一例外地存在于水樣層當(dāng)中。水樣層的容量大約為所加TRIZOL容量的60%。

⒊ RNA的沉淀 將水樣層轉(zhuǎn)移到一干凈的試管中，如果希望分離DNA和蛋白，有機(jī)層同樣要予以保留。通過將水樣層和異丙醇混合來沉淀RNA。最初均化時(shí)的每1 ml TRIZOL對應(yīng)0.5 ml異丙醇。將混合的樣品在15-30°C條件下孵育10分鐘并在2-8°C下以不超過12,000×g的離心力高速冷凍離心10分鐘。RNA沉淀在離心前通常不可見，形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。

4 .RNA的洗脫 移去上層懸液。用75%的乙醇洗滌RNA沉淀一次，每1 ml的 TRIZOL至少加1 ml的75%乙醇。旋渦振蕩混合樣品并在2-8°C下以不超過7,500×g的離心力高速冷凍離心5分鐘。

⒌ RNA的再溶解 在操作的最后，簡單干燥RNA沉淀(空氣干燥或真空干燥5-10分鐘)不要在真空管里離心干燥RNA。尤為重要的是，不能讓RNA沉淀干燥那樣會(huì)極大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA樣品其A260/280比值< 1.6。用移液管尖分幾次移取無RNA酶的水或0.5% SDS溶液來溶解RNA，并在55-60°C下孵育10分鐘(當(dāng)RNA以后要用于酶切反應(yīng)時(shí)，避免使用SDS。)RNA還能被100%甲酰胺(除去離子)再溶解并保存在–70°C。