本文摘要
蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(免疫印跡實(shí)驗(yàn))又稱為Western Blot。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。Western Blot主要用于檢測(cè)或分析蛋白,應(yīng)用領(lǐng)域集中在基因表達(dá)研究、抗體活性檢測(cè)和疾病診斷等。
01 蛋白質(zhì)印跡基本流程圖 02 western blot步驟樣品準(zhǔn)備:
在不使用預(yù)制膠的情況下,需要自行配置適合蛋白電泳SDS膠,采取自制膠的方法從加入緩沖液到制膠完成這一過程大概需要花費(fèi)將近1個(gè)小時(shí)。并且由于配比過程中的認(rèn)為誤差容易產(chǎn)生濃度不均一,穩(wěn)定性差,已出現(xiàn)外八型、笑臉型等條帶。采用天能系列預(yù)制膠具有較高的穩(wěn)定性和均一性,使蛋白電泳條帶更清晰銳利,使得條帶更加均勻。還有重要的一點(diǎn)就是可以免去制膠的時(shí)間,大大提升了實(shí)驗(yàn)效率。
蛋白轉(zhuǎn)印使用天能VE-586轉(zhuǎn)移電泳槽主要優(yōu)勢(shì)在于:它可以在不埋冰的情況完成的蛋白電泳,如果配合快速轉(zhuǎn)膜液,整個(gè)電泳過程只需不到30分鐘,可同時(shí)轉(zhuǎn)印4塊膠,操作方法也比較簡便。在縮短轉(zhuǎn)印時(shí)間的同時(shí),實(shí)現(xiàn)了蛋白樣品的高效轉(zhuǎn)印。
03 蛋白電泳目前常用的是SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳),蛋白質(zhì)會(huì)根據(jù)分子量大小分開,分子量的蛋白會(huì)留在膠的下部,分子量大的會(huì)在膠的頂部。
04 轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜主要是將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上,常用的是NC膜和PVDF(聚偏氟乙烯),由于膜與蛋白質(zhì)高度親和的能力,所以更容易與蛋白結(jié)合。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果,可以使用蛋白預(yù)染Marker,以方便判斷蛋白分子量大小。
蛋白預(yù)染的傳統(tǒng)方法是膜將置于脫色搖床上,用1×麗春紅染液振蕩預(yù)染5min。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。
蛋白轉(zhuǎn)印使用天能VE-586轉(zhuǎn)移電泳槽主要優(yōu)勢(shì)在于:它可以在不埋冰的情況完成的蛋白電泳,如果配合快速轉(zhuǎn)膜液,整個(gè)電泳過程只需不到30分鐘,可同時(shí)轉(zhuǎn)印4塊膠,操作方法也比較簡便。在縮短轉(zhuǎn)印時(shí)間的同時(shí),實(shí)現(xiàn)了蛋白樣品的高效轉(zhuǎn)印。
05 封閉轉(zhuǎn)印完成后,為阻止抗體的非特異性結(jié)合,需要用脫脂牛奶或者牛血清蛋白(BSA)作為緩沖液來填充封閉空白結(jié)合位點(diǎn)。
加入二抗稀釋液(一般1:1000甚至1:10000用TBST稀釋),放在搖床上,室溫下孵育1h后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次,每次10min;再用TBS洗一次,10min,即可進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。
注意:二抗孵育之后也要注意充分洗滌,一般30min左右為宜,如果洗膜不夠充分,顯影時(shí)會(huì)造成雜色背景。
06 ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng):在工作臺(tái)上鋪一張保鮮膜,將PVDF膜置于保鮮膜上。將ECL的A和B兩種試劑在EP管內(nèi)等體積混合(注意吸完A試劑后吸B試劑前要更換槍頭),然后均勻滴在PVDF膜的蛋白面,反應(yīng)1~2min后,將PVDF膜上多余的ECL發(fā)光液吸干,進(jìn)行固定。
07凝膠圖象分析將膠片進(jìn)行掃描或拍照,使用凝膠成像儀進(jìn)行成像分析。常用的凝膠成像儀有天能系列的T4600,T5200等系列。