貼壁293T細(xì)胞和懸浮293T細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的高密度培養(yǎng)具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。實(shí)驗(yàn)中，我們使用片狀載體分別對(duì)293T貼壁細(xì)胞和懸浮293T細(xì)胞在固定床生物反應(yīng)器中進(jìn)行高密度培養(yǎng)。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中采用連續(xù)灌流培養(yǎng)的方法，并借助片狀載體來(lái)支撐細(xì)胞的生長(zhǎng)。通過(guò)連續(xù)觀察葡萄糖消耗，我們?cè)u(píng)估了細(xì)胞培養(yǎng)的增殖能力和細(xì)胞密度的變化。
實(shí)驗(yàn)方法概要：
1. 需要的實(shí)驗(yàn)室儀器和試劑：
- 3.5L固定床生物反應(yīng)器 x 2
- 150g 片狀載體
- 貼壁293T細(xì)胞
- 懸浮293T細(xì)胞
- DMEM培養(yǎng)基
- 葡萄糖溶液
- 無(wú)菌培養(yǎng)皿
- 離心管
- 顯微鏡
2. 貼壁293T細(xì)胞的培養(yǎng)：
a. 在培養(yǎng)皿中加入足夠的DMEM培養(yǎng)基，并補(bǔ)充10%的胎牛血清。
b. 將貼壁293T細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，使其達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
c. 用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液將細(xì)胞從培養(yǎng)皿中解離。
d. 離心細(xì)胞，去除上清液，用DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞。
e. 鑒定細(xì)胞數(shù)目并調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×107個(gè)/mL。
3. 懸浮293T細(xì)胞的培養(yǎng)：
a. 在培養(yǎng)皿中加入足夠的DMEM培養(yǎng)基，并補(bǔ)充10%的胎牛血清。
b. 將懸浮293T細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，使其達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
c. 用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液將細(xì)胞從培養(yǎng)皿中解離。
d. 離心細(xì)胞，去除上清液，用DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞。
e. 鑒定細(xì)胞數(shù)目并調(diào)整細(xì)胞濃度至2.3×107個(gè)/mL。
4. 固定床生物反應(yīng)器的裝填：
a. 準(zhǔn)備2個(gè)3.5L固定床生物反應(yīng)器。
b. 在每個(gè)生物反應(yīng)器中加入75g片狀載體。
c. 用無(wú)菌操作將貼壁293T細(xì)胞接種在一個(gè)生物反應(yīng)器中，將懸浮293T細(xì)胞接種在另一個(gè)生物反應(yīng)器中。
5. 連續(xù)灌流培養(yǎng)：
a. 連續(xù)灌流培養(yǎng)開(kāi)始前，將生物反應(yīng)器和培養(yǎng)基預(yù)熱至37℃。
b. 確保培養(yǎng)基通過(guò)生物反應(yīng)器的速度為1個(gè)床體積/小時(shí)。
c. 每隔12小時(shí)，取出一定量的培養(yǎng)基樣品，用離心管離心10分鐘。
d. 分離上清液并測(cè)定葡萄糖濃度。
e. 根據(jù)葡萄糖消耗情況來(lái)調(diào)整培養(yǎng)基的流速，以維持葡萄糖濃度在合適范圍內(nèi)。
f. 持續(xù)進(jìn)行連續(xù)灌流培養(yǎng)6天，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度的變化。
結(jié)果：
貼壁293T細(xì)胞和懸浮293T細(xì)胞均能在固定床生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)。6天后，貼壁293T細(xì)胞的細(xì)胞密度達(dá)到2.5×107個(gè)/mL，懸浮293T細(xì)胞的細(xì)胞密度達(dá)到2.3×107個(gè)/mL，細(xì)胞的增殖約為50倍。
討論與結(jié)論：
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明貼壁293T細(xì)胞和懸浮293T細(xì)胞在固定床生物反應(yīng)器中均能實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)。貼壁293T細(xì)胞的細(xì)胞密度稍高于懸浮293T細(xì)胞，但差異不明顯。固定床式生物反應(yīng)器的連續(xù)灌流培養(yǎng)方法適用于兩種細(xì)胞的培養(yǎng)，為后續(xù)的生物工程研究提供了可行的培養(yǎng)工藝。該實(shí)驗(yàn)方法可為進(jìn)一步研究和應(yīng)用貼壁和懸浮293T細(xì)胞的生物反應(yīng)器培養(yǎng)提供參考。
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