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NC膜與PVDF膜的區(qū)別

 更新時間:2023-07-13 點擊量:4428
NC膜與PVDF膜的區(qū)別:

膜的選擇,印跡所使用的膜的類型可能影響下列因素:


•蛋白質(zhì)結(jié)合能力
• 是否需要用醇預濕
• 蛋白質(zhì)觀察
• 長期印跡保存
• 信噪比
• 開展多次剝離(stripping)和再生檢測(reprobing)實驗的能力


NC膜和PVDF膜是Western blotting中常用的兩種膜。NC膜是世界上使用最為廣泛的特異性轉(zhuǎn)移介質(zhì)之一,也是最早用于Western blotting的膜。PVDF膜在1985年被開發(fā)出來,在嚴苛條件下表現(xiàn)出更高的蛋白保留,比如有機溶劑存在時,或者在酸性或堿性條件下。

NC膜與蛋白質(zhì)之間靠靜電和疏水作用結(jié)合,NC膜是親水膜,無需預先活化,對蛋白質(zhì)的活性影響?。槐尘暗?;價格低廉,使用方便。缺點是韌性較差,易損壞,不能反復使用。在非離子型去污劑作用下,結(jié)合的蛋白容易被洗脫下來。

PVDF膜與蛋白質(zhì)之間靠疏水作用結(jié)合,與NC膜相比,PVDF膜有著更高的機械強度和出色的化學穩(wěn)定性,適合多次剝離(stripping)和反復檢測(reprobing)。同時,PVDF膜有著更高的結(jié)合能力,NC膜的典型結(jié)合能力是80 -100 μg/cm2,而PVDF膜達到150-160 μg/cm2 (結(jié)合強度 PVDF膜比NC膜強 6 倍),這意味著靈敏度更高。由于PVDF膜的疏水性,成為疏水蛋白質(zhì)(如膜蛋白)的機構疏松。也正因為如此,PVDF膜需要甲醇潤濕才能被常規(guī)的轉(zhuǎn)膜液所浸潤,繼而進行轉(zhuǎn)膜與蛋白結(jié)合。

綜上,現(xiàn)階段實驗室印跡轉(zhuǎn)印膜常用PVDF膜而非NC膜。


PVDF膜.jpg


PVDF膜結(jié)合蛋白的機理:


在分子水平,蛋白質(zhì)吸附至少部分源于疏水氨基酸側(cè)鏈與聚合物表面疏水區(qū)的相互作用。Matsudaira(1987)觀察到,在疏水殘基被切割之后,小肽的測序效率下降80%,這可能是由于殘余肽段被洗脫。同時,在肽段消化降解時,也觀察到疏水肽段往往不能像親水肽段那樣高效洗脫(Iwamatsu,1991;Fernandez等,1992)。McKeon和Lyman(1991)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)印緩沖液中添加的Ca2+離子可增強鈣調(diào)蛋白與Immobilon®-P轉(zhuǎn)印膜的結(jié)合。鈣的結(jié)合導致蛋白質(zhì)分子結(jié)構中形成一個疏水袋,從而增加蛋白與膜的結(jié)合。

綜上,PVDF膜結(jié)合蛋白的機理:PVDF膜的表面具有疏水性,而許多蛋白質(zhì)也具有疏水性區(qū)域,PVDF膜表面和蛋白質(zhì)疏水區(qū)域之間發(fā)生疏水作用導致其相互結(jié)合。

PVDF膜為什么需預先活化:

PVDF膜本質(zhì)是一種疏水性的聚合物,具有疏水性且不帶電荷,不能被轉(zhuǎn)膜液所浸潤,為了在水性緩沖液中使用,需要在使用前進行預處理以浸潤和活化膜。最常見的方法是使用50%(v/v)或更高濃度的醇(甲醇、乙醇和異丙醇)溶液浸潤和活化,使PVDF膜中微孔內(nèi)的空氣被低表面張力的甲醇所替代,從而易于后續(xù)水或者緩沖液進入PVDF膜中的微孔內(nèi),使PVDF膜從疏水性變成親水性,隨著膜的外觀從不透明變?yōu)榘胪该?,表明PVDF膜已經(jīng)浸濕。之后用水反復沖洗以去除醇類,再將膜直接放入轉(zhuǎn)印緩沖液中平衡。一旦膜被浸濕,通過電轉(zhuǎn)移,蛋白質(zhì)與膜接觸產(chǎn)生疏水作用而被吸附在PVDF膜上。


PVDF膜孔徑對蛋白結(jié)合的影響:


在電轉(zhuǎn)移過程中,蛋白與膜的結(jié)合貫穿整個膜的厚度(深度),結(jié)合能力是由孔的內(nèi)部表面積來決定的(Mansfield,1994)。隨著膜孔徑的不斷減小,膜對低分子量的蛋白結(jié)合就越牢固,但是膜孔徑如果小于0.1 μm,蛋白的轉(zhuǎn)移就很難進行了,原因是蛋白質(zhì)分子的直徑大約在1-100納米之間。

PVDF膜孔徑越小對低分子蛋白吸附越牢固的機理:較小的孔徑會限制蛋白分子的運動,使其轉(zhuǎn)移速度變慢,蛋白與膜的結(jié)合更充分,更容易被攔截在孔道內(nèi)。此外,較小的孔徑也可以提供更高的膜表面積,從而提高了蛋白與膜接觸的機會。同時,較小的孔徑也可以提供更高的表面密度,從而增加了孔道與溶液之間的分子間吸引力,這種吸附方式稱為“毛細作用"。Schweitzer和Kriz在一項研究中發(fā)現(xiàn),較小的孔徑可以提供更高的蛋白密度并增強其吸附能力。另一方面,蛋白分子量越低,蛋白的比表面積越大,與膜接觸面越大越充分,結(jié)合更緊密。

通常情況下,大于20 kD的蛋白選擇0.45 μm的膜,小于20 kD的蛋白選擇0.2 μm的膜。0.2 μm PVDF膜內(nèi)部表面積大約是0.45 μm PVDF 膜的三倍,使其吸附能力更高??傊?,選擇PVDF膜的孔徑大小需要根據(jù)樣品蛋白的大小和特性來確定,以獲得較好的結(jié)合效果。