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腫瘤細胞特點和細胞培養(yǎng)技術

 更新時間:2023-06-20 點擊量:747

  腫瘤細胞在組織培養(yǎng)中占據較為重要地位。腫瘤細胞相對容易培養(yǎng),腫瘤細胞系是目前建立的細胞類型中數量較多的。此外,腫瘤是人類疾病的大威脅。因此,腫瘤細胞培養(yǎng)已成為了解癌癥機制和開發(fā)抗癌藥物的新技術。本指南旨在作為腫瘤細胞培養(yǎng)的基本介紹,包括培養(yǎng)基、傳代培養(yǎng)、冷凍保存和污染防治。

腫瘤細胞的生物學特性

腫瘤細胞在體內外與正常細胞在形態(tài)、生長值、遺傳性狀等方面均有顯著差異。體外培養(yǎng)的兩種腫瘤細胞定義的差異很小,但卻不相同。培養(yǎng)的腫瘤細胞具有以下特征:

1.不斷分化,持續(xù)生長

正常細胞的生長和死亡受到嚴格控制。細胞使用細胞外信號來調節(jié)分裂的速率和位置。一般來說,細胞凋亡可以由正常的生命程序觸發(fā)。相反,腫瘤細胞提供了一種機制,使它們能夠繞過細胞周期檢查點并抑制細胞凋亡。在癌細胞中,有絲分裂可以連續(xù)發(fā)生,產生過多的細胞以形成腫瘤。

腫瘤細胞正常凋亡

2.無接觸抑制

正常細胞會分裂,直到它們與鄰近的細胞接觸,然后它們會停止生長并形成單層細胞。而癌細胞通常會失去這種接觸抑制,導致它們堆積并形成腫瘤。

腫瘤的擴散

3.侵入性

正常細胞通常位于固定位置直至死亡。但是腫瘤細胞能夠擴散到或侵入附近的組織。此外,一些腫瘤細胞可以脫落并通過血液或淋巴系統(tǒng)轉移到體內遠處,形成遠離原發(fā)腫瘤的新腫瘤。

腫瘤細胞培養(yǎng)原理

細胞培養(yǎng)的基礎知識現(xiàn)在相對普遍,盡管并非總是如此。細胞培養(yǎng)的主要條件是光線充足且通風良好的實驗室,配備的實驗室儀器應包括層流罩(II 級)、CO2培養(yǎng)箱、生物安全柜、臺式離心機、顯微鏡、塑料器皿(燒瓶和培養(yǎng)板)以及含有或不含血清補充劑的培養(yǎng)基.

養(yǎng)基和血清

大多數培養(yǎng)基是添加了各種成分的基礎鹽水培養(yǎng)基。在這種含鹽培養(yǎng)基的基礎上,添加了氨基酸、維生素、金屬離子、微量元素和能量來源(通常以葡萄糖形式提供)以滿足細胞的需要。其他添加劑包括緩沖液和酚紅以指示培養(yǎng)物的酸度。

表 1. 常用培養(yǎng)基。

類型

應用

基礎培養(yǎng)基 (BME)

二倍體和原代細胞培養(yǎng)物,例如 HeLa、L 細胞和原代哺乳動物成纖維細胞

非必需培養(yǎng)基 (MEM)

懸浮和貼壁哺乳動物細胞

細胞因子

保護和維持大多數哺乳動物細胞的生長

細胞生長因子

人微血管內皮細胞

RPMI 1640

大多數哺乳動物和雜瘤細胞,例如人類骨髓瘤、小鼠雜瘤、人類白細胞、B 和 T 淋巴細胞

   血清通常被添加到上述培養(yǎng)基中以替代許多缺失的需求。存在的成分濃度通常在 5-20% 之間變化,具體取決于細胞類型,并且使用新生兒或胎牛血清的做法已變得很普遍。由于批次之間存在差異,因此最好堅持使用一家發(fā)現(xiàn)與特定細胞系合作良好的供應商。血清可分成等分試樣并冷凍在-20°C。

有些細胞類型不能在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng),例如人微血管內皮細胞。在現(xiàn)有的基礎培養(yǎng)基中添加特定的添加劑或增加各種成分的濃度都可以滿足特殊要求。 

繼代培養(yǎng)

傳代培養(yǎng)是通過將部分或全部細胞從以前的培養(yǎng)物轉移到新鮮的生長培養(yǎng)基中而產生新細胞或微生物培養(yǎng)物的過程。不同的細胞類型具有特定的傳代培養(yǎng)要求、優(yōu)選的密度范圍和最佳生長的良好條件。所以更多的細節(jié)請參考我們網站上的具體技術公告。

冷凍保存

 為了有效地儲存細胞,然后回收足夠高的比例用于質量研究,必須監(jiān)測儲存條件并保存良好的記錄。

  凍融引起的細胞損傷一般認為是由細胞內冰晶和滲透作用引起的。添加冷凍保護劑,如二甲基亞砜 (DMSO) 或甘油,并選擇合適的冷凍和解凍速率可最大限度地減少細胞損傷。雖然可以使用機械冷凍機 (-75°C) 短期儲存細胞系,但更優(yōu)選儲存在液氮 (-196°C) 或其蒸氣(至 -135°C)中。使用液氮冰箱是有利的,不僅因為較低的溫度,因此幾乎可以無限存儲時間,而且還因為沒有機械故障的風險,并且現(xiàn)在可以延長保存時間。

細胞培養(yǎng)過程中的污染

細胞培養(yǎng)應染色無菌,定期進行無菌檢測是必要的。雖然細胞培養(yǎng)物可能在內源性(主要是病毒)感染中產生,但大多數感染和污染是后天獲得的。以下是一些常見的文化污染,但不限于:

細菌

細菌是一大群普遍存在的單細胞微生物。由于它們的普遍存在、大小和快速生長速度,細菌是細胞培養(yǎng)中最常見的生物污染物之一。如果存在,通過肉眼觀察很容易檢測到酚紅會變黃,并且在倒置顯微鏡下細胞會被細菌菌落取代。向培養(yǎng)物中添加抗生素是常見的做法,這可以在相當長的時間內掩蓋低水平感染。

細菌感染 圖4

霉菌

霉菌是真菌界的真核微生物。與細菌污染不同,培養(yǎng)物的 pH 值在污染的初始階段會保持穩(wěn)定,然后隨著培養(yǎng)物受到更嚴重的感染并變得混濁而迅速升高。在顯微鏡下,通常會出現(xiàn)菌絲體。一般來說,在培養(yǎng)物中加入抗生素,就能在一定程度上降低感染程度。

霉菌污染5

酵母菌

酵母是單細胞真核微生物,類似于霉菌污染,被酵母污染的培養(yǎng)物變得渾濁,特別是如果污染處于晚期。被酵母污染的培養(yǎng)物的 pH 值可能不會變化太多,直到污染變重,在這個階段 pH 值通常會增加。在顯微鏡下,很明顯酵母表現(xiàn)為單個卵形或球形顆粒,甚至可能會長出更小的顆粒。向培養(yǎng)物中添加抗生素效果不佳。大多數實驗室通常會處理受感染的培養(yǎng)物并重新開始。

酵母污染6

酵母污染細胞

支原體

支原體可能是細胞培養(yǎng)實驗室中最常見和最容易被遺漏的感染,其影響是陰險的??赡艽嬖趩栴}的指標包括生長速度降低、形態(tài)變化、染色體畸變和新陳代謝改變。有多種檢測支原體的方法,可以使用支原體清除試劑盒進行清除或預防。

病毒

一些細胞系包含病毒,包括整合到它們的基因組中,或作為內源性非致死性感染。在許多情況下,這些不被視為感染,細胞的病毒轉化是產生連續(xù)細胞系的歷史悠久的方法。然而,使用病毒感染的細胞培養(yǎng)物會對實驗室人員造成嚴重的健康危害,尤其是在實驗室培養(yǎng)人類或靈長類動物細胞時。

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