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3T3-L細(xì)胞誘導(dǎo)分化操作步驟

 更新時(shí)間:2023-06-14 點(diǎn)擊量:698
3T3-L細(xì)胞誘導(dǎo)分化操作步驟

3T3-L1 (小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)是從3T3細(xì)胞(Swissalbino)中經(jīng)克隆分離得到的連續(xù)傳代的亞系。該細(xì)胞從快速分裂到匯合和接觸性抑制狀態(tài)經(jīng)歷了前脂肪細(xì)胞到脂肪樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。該細(xì)胞鼠痘病毒陰性;可產(chǎn)生甘油三酯,高濃度血清可增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積。可用于研究糖尿病,肥胖癥等。
細(xì)胞名稱:小鼠胚胎成纖維(經(jīng)成脂分化驗(yàn)證)
細(xì)胞簡稱:3T3-L1
產(chǎn)品貨號(hào):TCM-C702
種屬來源:小鼠
組織來源:胚胎
細(xì)胞形態(tài):成纖維細(xì)胞樣
生長特性:貼壁生長
培養(yǎng)體系:DMEM-H+10%CS(新生牛血清)+1%P/S
配套培養(yǎng)基貨號(hào):TCM-G702
傳代比例:1:3-1:4,每2-3天換液一次
傳代周期:48-72 h
培養(yǎng)條件:氣相:95%空氣+5%CO?,溫度:37℃
凍存條件:60%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+30%FBS+10%DMSO,液氮儲(chǔ)存推薦海星Hycyte® 一步凍存液(即用型、無血清、無需程序降溫)

 3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

細(xì)胞密度:細(xì)胞密度是影響3T3-L1細(xì)胞分化的重要因素,過低或過高的細(xì)胞密度都會(huì)影響分化效果;密度一般控制在90%的匯合度,如果太低,則會(huì)影響細(xì)胞生長和分化,如果太高,則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡和分化受阻。

培養(yǎng)基:3T3-L1細(xì)胞最適宜的培養(yǎng)基是DMEM高糖+10%新生牛血清。
傳代:3T3-L1細(xì)胞的傳代次數(shù)應(yīng)該控制在10次以內(nèi),否則會(huì)影響細(xì)胞的生長和分化。在進(jìn)行傳代時(shí),需要注意細(xì)胞的消化過程,細(xì)胞對(duì)胰酶比較敏感,添加胰酶后約1分鐘內(nèi)細(xì)胞會(huì)脫落,因此消化時(shí)間的把控極其重要,同時(shí)避免過度打碎細(xì)胞團(tuán),以保證細(xì)胞的生長和分化能力。

3T3-L1細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化操作步驟

前脂肪細(xì)胞是一類同時(shí)具有增殖和分化為成熟脂肪細(xì)胞能力的前體細(xì)胞,此種前體細(xì)胞在不同的生長因子、激素等物質(zhì)的作用下,經(jīng)歷有絲分裂克隆期、生長停滯期、進(jìn)一步的克隆期、終末分化四個(gè)階段,細(xì)胞本身的成纖維狀態(tài)發(fā)生改變,通過胞質(zhì)內(nèi)甘油三脂聚集形成成熟脂肪細(xì)胞。誘導(dǎo)完成后,經(jīng)油紅O染色,就可以在鏡下觀察到甘油三脂脂肪滴的生成。

1.成脂誘導(dǎo)分化操作

1.1 接種干細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長期3T3-L1的細(xì)胞,按照2.0×10^4cells/c㎡的細(xì)胞密度接種至培養(yǎng)器皿,于37℃,5%CO?培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)至匯合度90%,棄掉上清,加入成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)液。

NOTE:如細(xì)胞貼壁性較差,建議使用 0.1%明膠對(duì)培養(yǎng)底 面進(jìn)行包被。

1.2 細(xì)胞分化誘導(dǎo)于37℃,5%CO?培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)約3天,更換為成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基維持液,培養(yǎng)1天后, 再更換為成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)液,繼續(xù)培養(yǎng)3天。
 按照以上換液頻率誘導(dǎo)14~21天,并注意觀 察細(xì)胞形態(tài)變化。根據(jù)細(xì)胞誘導(dǎo)形成的脂滴數(shù)量 和大小,決定終止細(xì)胞誘導(dǎo)的時(shí)間,并進(jìn)行染色 鑒定。
2.染色鑒定
2.1 細(xì)胞固定吸去培養(yǎng)基使用適量1×PBS清洗一次,棄去后取適量4%中性甲醛溶液覆蓋培養(yǎng)器皿底面,室 溫固定 30~60 min,棄去固定液再使用1×PBS清洗兩次。
2.2 油紅O染色取生理鹽水或1×PBS與油紅O原液配制油紅O工作液(油紅O原液: 生理鹽水=3:2),現(xiàn)用現(xiàn) 配。配制后可對(duì)油紅O工作液進(jìn)行離心,以沉淀 染色液中的過飽和析出物。向清洗干凈的誘導(dǎo)孔內(nèi)加入適量油紅O工作液,靜置染色30min。吸走油紅O工作液,用1×PBS清洗兩次,并加入適量1×PBS避免細(xì)胞干燥。
2.3誘導(dǎo)評(píng)估顯微鏡下觀察成脂染色效果,并進(jìn)行圖像采集和誘導(dǎo)評(píng)估。誘導(dǎo)成功時(shí),脂滴與油紅O染料 結(jié)合后呈現(xiàn)紅色或橘紅色。

NOTE: 成脂分化水平因細(xì)胞類型、培養(yǎng)條件、細(xì)胞代次、細(xì)胞狀態(tài)和分化時(shí)間等因素而異。


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