SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳原理:
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS(十二烷基硫酸鈉), SDS會(huì)與變性的多肽,并使蛋白帶負(fù)電荷,由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關(guān),因此SDS多肽復(fù)合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關(guān),在達(dá)到飽和的狀態(tài)下,每克多肽可與1.4g去污劑結(jié)合。
當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí),蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW為分子量,X為遷移率,k、b均為常數(shù),若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖,可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳,根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳常用試劑及設(shè)備
試劑:蛋白值樣品,SDS-PAGE loading buffer,PBS,Tris-Hcl (PH 8.8), Tris-Hcl (PH 6.8) ,30%丙烯酰胺,10%SDS,10%過硫酸,5×SDS-PAGE電泳緩沖液,考馬斯亮藍(lán)R-250染色液,脫色液、天能預(yù)制膠。
儀器耗材:垂直電泳槽,電泳儀,電泳儀電源,移液槍,移液槍tip吸頭,離心管、試劑瓶。
實(shí)驗(yàn)步驟
一、凝膠配置
1.分離膠的配制
(1)找出配套的膠板,用擦鏡紙擦干凈,并固定在配膠器上。隨后用去離子水試漏;
(2)若膠板不漏水,就進(jìn)行分離膠的配制。依次將水、30%丙烯酰胺、1.5M Tris-Hcl(PH 8.8)、10%SDS、10%過硫酸銨加到干凈的小燒杯中,混勻(1mm的膠板,一般配一塊膠用5ml。所配的膠濃度一般為12%,但濃度也要視情況而定。蛋白越小,膠的濃度越大);
(3)將膠板中的水倒掉,并用濾紙吸干水分(不要將濾紙塞到膠板底部);
(4)小燒杯中再加入TEMED,混勻。(TEMED可使膠凝固,所以最后加);
(5)灌膠:混勻的分離膠沿著膠板邊緣輕輕灌下,防止產(chǎn)生氣泡;
(6)用水將分離膠壓平(用水灌滿,同時(shí)加水時(shí)要緩慢加入,防止把膠吹起)。
也可以直接使用預(yù)制膠,預(yù)制膠直接拆開即用,不用配制。
2.濃縮膠的配制
(1)待分離膠與水中間形成明顯的橫線,即分離膠凝固。隨后進(jìn)行濃縮膠的配制,依次將水、30%丙烯酰胺、1.0M Tris-Hcl(PH 6.8)、10%SDS、10%過硫酸銨加到干凈的小燒杯中;
(2)將分離膠上層的水倒掉,并用濾紙吸干水分(盡量不要把濾紙插入);
(3)小燒杯中再加入TEMED,混勻;
(4)灌膠。然后插入梳子;
(5)把制膠器倒過來,膠仍然不會(huì)往外流,或可以明顯看出梳子中兩個(gè)齒之間的膠面明顯凹下去,說明濃縮膠凝固。將凝固的膠板裝入電泳槽內(nèi),并在電泳槽內(nèi)加入SDS-PAGE電泳緩沖液,把膠浸泡一段時(shí)間,時(shí)間越長越好(防止梳子與膠相連,或膠因濕度不夠而縮減);
(6)點(diǎn)樣時(shí),再把梳子拔出來,拔時(shí)動(dòng)作要輕,防止膠齒被拔斷。
二、SDS-PAGE電泳步驟
1、調(diào)膠:拔掉SDS膠上的梳子,并用小針調(diào)整齒的位置(使它們都平行)。
2、點(diǎn)樣:用20µL的小槍頭,吸煮過的樣品10µL,對準(zhǔn)膠孔點(diǎn)樣,注意不要把樣品點(diǎn)在外面。使用適當(dāng)?shù)姆肿恿康鞍譵arker。
3、電泳:電泳儀正負(fù)極接好,打開電源。濃縮膠:電壓 low 100V,分離膠:電壓 high 150V。
4、卸膠:等膠內(nèi)的所有的藍(lán)色都跑出去,電泳停止,一般時(shí)間為1-2小時(shí)左右。把膠板從電泳儀上卸下,用刀片把膠板撬開,膠的濃縮膠部分割除;
5、染色:放入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中進(jìn)行常溫過夜染色;
5、脫色:將過夜染色的SDS-PAGE膠放入脫色液中進(jìn)行脫色,直到背景發(fā)白。
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