CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟

  CCK-8實(shí)驗(yàn)可用于細(xì)胞因子等誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖檢測(cè)，也可以用于抗癌藥物等對(duì)細(xì)胞有毒試劑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性檢測(cè)，或一些藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制檢測(cè)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值，可間接性反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)量。使用CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)是一種高靈敏度，無(wú)放射性的比色檢測(cè)法。
CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟：
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
酒精燈、移液槍、酶標(biāo)儀（帶有450nm濾光片）、96孔培養(yǎng)板、CO2培養(yǎng)箱、CCK-8、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、PBS等。
二、繪制曲線
1.制備細(xì)胞懸液：選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制作細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)。
2.在96孔板中接種細(xì)胞懸液 (100 μL/孔) ：按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做5-7個(gè)細(xì)胞濃度梯度（比如，稀釋10倍，100倍......），每組4-6個(gè)復(fù)孔。
3.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：接種后培養(yǎng)一定時(shí)間待細(xì)胞貼壁后，然后每100μL培養(yǎng)基加10μL（10%）CCK-8試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)定OD值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可測(cè)定出未知樣品在條件一致的前提下的細(xì)胞數(shù)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線還有助于確定細(xì)胞接種的合適數(shù)量以及摸索CCK-8后所需孵育時(shí)間。
三、細(xì)胞增殖檢測(cè)

1.制備細(xì)胞懸液：選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制作細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)。
2.在96孔板中接種細(xì)胞懸液 (100 μL/孔) ：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)（根據(jù)自身的細(xì)胞類(lèi)型而定，以一周能鋪滿(mǎn)為宜，若為血液細(xì)胞密度可適當(dāng)增大），每孔接種約100ul細(xì)胞懸液，每組設(shè)置4-6個(gè)復(fù)孔。
①當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1000 個(gè)/孔(100μl培養(yǎng)基)。檢測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于2500 個(gè)/孔(100μl培養(yǎng)基)。懸浮細(xì)胞由于染色比較困難一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。
②當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。為減少誤差，最外一圈的孔只加100ul PBS、水或者培養(yǎng)液，不作為測(cè)定孔用。
③接種時(shí)注意細(xì)胞懸液一定要混勻，以避免細(xì)胞沉淀下來(lái)，導(dǎo)致每孔中的細(xì)胞數(shù)量不一致。3.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（37℃，5% CO2）12-24小時(shí)，使細(xì)胞達(dá)到指數(shù)期（培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)的不同和每孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的多少而異）。
4.每孔加入10ul CCK-8試劑
①由于每孔加入CCK-8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來(lái)誤差，建議直接配置含10% CCK-8培養(yǎng)基（現(xiàn)用現(xiàn)配）以換液的形式加入。注意加CCK-8試劑時(shí)不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)。加CCK-8試劑時(shí)速度要快，減少試劑在移液器上的殘留，加入CCK-8試劑后輕輕震培養(yǎng)板。
②加CCK-8試劑時(shí)間可分別在22h、46h、70h、94h時(shí)加入，也可以在24h、48h、72h、96h時(shí)再加入。重要的是需保證實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在同一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
③若細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，培養(yǎng)基顏色或 pH 發(fā)生變化，建議更換培養(yǎng)基后再加 CCK-8。5.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)0.5-4小時(shí)①培養(yǎng)時(shí)間因孔中細(xì)胞的類(lèi)型和數(shù)量而異，需要自己摸索，因?yàn)榧?xì)胞種類(lèi)不同，形成Formazan的量也不一樣。
②如果顯色太淺的話(huà)，可以將96孔板置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，可參考標(biāo)準(zhǔn)曲線確定培養(yǎng)時(shí)間。
③一般情況下，白細(xì)胞著色較弱，因此可能需要較長(zhǎng)的孵育時(shí)間（最多 4 h）或增加細(xì)胞數(shù)量。
④CCK-8 的反應(yīng)時(shí)間以具體顯色的適宜時(shí)間為準(zhǔn)?？稍?.5h、1.0h、2.0h分別觀察培養(yǎng)基的顏色。最佳OD 值控制在1.0左右較合適。6.使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)的吸光度（OD值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值作為最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

空白對(duì)照的設(shè)定：在同體積的培養(yǎng)基中加入CCK-8，培養(yǎng)同樣的時(shí)間，和實(shí)驗(yàn)組一起測(cè)定450nm的吸光度。
①使用酶標(biāo)儀檢測(cè)時(shí)記得打開(kāi)96孔板蓋子，需保證酶標(biāo)板的表面以及板底是干凈的，且每個(gè)待測(cè)孔內(nèi)沒(méi)有氣泡，以免干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
②如果結(jié)果出現(xiàn)“overflw"則需降低細(xì)胞接種密度，如果因?qū)嶒?yàn)需要不能減少細(xì)胞數(shù)時(shí)可縮短加入CCK-8后的培養(yǎng)時(shí)間。
③如果樣品為高渾濁的細(xì)胞懸液，建議采用雙波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)450-490nm，參比波長(zhǎng)600-650nm。（CCK-8 在參比波長(zhǎng)處沒(méi)有吸光值，設(shè)定參比波長(zhǎng)的目的是為了去除由于樣品渾濁所帶來(lái)的吸收。）
④若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。
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