原生質(zhì)體葉肉細胞瞬時表達方法

1、 生長培養(yǎng)好的試驗材料（一般為生長20天左右的擬南芥幼苗葉片）

2、 在擬南芥開花前取樣（30片葉子左右即可）

3、 切取葉片為0.5-1mm的細條（如果材料能達到每克10⁷個原生質(zhì)體， 10-20片葉子需要5-10mL酶解液）

4、 迅速將切下的樣品轉(zhuǎn)到酶解液中，要求全部浸沒。

5、 黑暗條件下抽真空30min。

6、 連續(xù)酶解，室溫下23℃黑暗中靜止酶解3h

7、 利用光學顯微鏡檢查原生質(zhì)體（30-50μm大小）

8、 在過濾前加入等量的W5溶液

9、 洗干凈濾網(wǎng)，并用W5潤濕，之后過濾

10、 離心100g，1-2min沉淀原生質(zhì)體，盡可能吸走上清，重復洗2 次

11、 重懸原生質(zhì)體于W5中，保持在2*10⁵個 /ml，冰浴30min。

12、 100g離心2min，盡可能吸走上清，利用MMG重懸，濃度約 2*10⁵個/ml

13、 加入10μL質(zhì)粒（1000ng-2000ng ）于2ml離心管中

14、 加入100μL原生質(zhì)體（2*10⁴個），輕輕混勻。

15、 加110μL PEG solution，輕彈使充分混勻

16、 23℃室溫孵育30min。

17、 加400-440μL W5混勻，終止反應

18、 100g，2min 23℃離心，去上清，重復洗一次

19、 用1mL W5重懸原生質(zhì)體并放入6孔板中培養(yǎng)

20、 20-25℃孵育16h以上

21、 取樣制片觀察

溶液配制：

1、 酶解液的配制（20ml）

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