l 1x RIPA 緩沖液:50 mM Tris、 150 mM NaCl 、0.1% SDS、0.5% 脫氧膽酸鈉、 1% Triton X-100 或 NP40。
l 1x PBS 緩沖液:137 mM NaCl、2.7 mM KCl 、2.7 mM Na 2 HPO 4、2.7 mM KH 2 PO 4、 pH 7.4
l BCA 蛋白檢測試劑盒或 Bradford 蛋白檢測試劑盒
l 1.5 M Tris 緩沖液 (pH 8.8): 90.68 g Tris-HCl 至 ddH 2 O,使用 HCl 將 pH 調(diào)節(jié)至 8.8,最后 500 ml
l 1.0 M Tris 緩沖液 (pH 6.8):60.58 g Tris-HCl 至 ddH 2 O,使用 HCl 將 pH 調(diào)節(jié)至 6.8,最后 500 ml
l 10% APS:使用前制備的 1 ml ddH 2 O中的 100 mg AP 。
l 10% SDS:10 g SDS 在 100 ml ddH 2 O 中。
l 1x Tris-甘氨酸緩沖液:Tris配比25 mM; PH=8.3 的甘氨酸配比230 mM、 SDS配比0.1% 。
l 3x SDS 蛋白上樣緩沖液配制:使用PH=6.8 的 Tris 150 mM 、SDS添加6% 、甘油 添加30% 、 EDTA濃度30 mM 和 溴酚藍(lán) 配比0.2% 。緩沖液應(yīng)隨用隨配、分裝冷凍備用。1x TTBS : 25 mM Tris(pH 7.5):0.15 M NaCl 、 0.05% Tween-20、0.001% 硫柳汞
l 1x 轉(zhuǎn)移緩沖液:3 g Tris、14.4 g 甘氨酸和 200 ml 甲醇,添加 ddH 2 O 至 1L
l 去除上清液并用 1X PBS 洗滌以去除殘留培養(yǎng)基。
l 添加預(yù)冷的 400 ul-1 ml 1X RIPA 緩沖液/100 mm 培養(yǎng)皿。在冰上孵育 5-10 分鐘。
l 刮去細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到冰上預(yù)冷的 1.5 ml 微管中。
l (可選)均質(zhì)化或超聲處理。
l 4°C 12,000 rpm 離心 10-15 分鐘,收集上清液備用。
l 總蛋白應(yīng)儲存在 -20°C 直至需要。
l (可選)取出 100 ul 等分試樣進行細(xì)胞計數(shù)。
l 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的 1.5 ml 微管或 15 ml 試管中,并在 4°C 下以 2000 rpm 的速度離心 5 分鐘。
l 取出培養(yǎng)基,用 1 ml 預(yù)冷的 1x PBS 重懸沉淀,然后轉(zhuǎn)移到 1.5 ml 微管中。
l 在 4°C 下以 2000 rpm 離心 5 分鐘。
l 用 1 ml 預(yù)冷 RIPA 緩沖液/10 7 個細(xì)胞重懸細(xì)胞沉淀
l 將細(xì)胞懸液在冰上搖晃 30 分鐘?;蚓|(zhì)化/超聲處理。
l 4°C 12000 rpm 離心 10-15 分鐘,收集上清液備用。
l 總蛋白應(yīng)儲存在 -20°C 直至需要。
l 組織制備和定量。把它們切成小塊。
l 添加約 500-600 ul 預(yù)冷的 1x RIPA 緩沖液/100 mg 組織。
l 均勻組織。
l 在 4°C 下以 12000 rpm 離心 15-20 分鐘。
l 收集上清液備用。
l 總蛋白應(yīng)儲存在 -20°C 直至需要。
分離凝膠濃度(%) | 蛋白質(zhì)大小范圍 (kDa) |
8 | 25-200 |
10 | 15-100 |
12.5 | 10-70 |
15 | 12-45 |
20 | 4-40 |
溶解凝膠(10ml) | 濃縮凝膠(3ml) | |||||
6% | 8% | 10% | 12% | 15% | ||
H 2 0 | 5.3 | 4.6 | 4.0 | 3.3 | 2.3 | 2.1 |
30% 丙烯酰胺混合物* | 2.0 | 2.7 | 3.3 | 4.0 | 5.0 | 0.5 |
1.5M Tris(pH 8.8) | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 1.0M Tris (pH 6.8) 0.38 |
10% SDS | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.03 |
10% APS | 0.1 | 0.1 | 0.1 | .1 | 0.1 | 0.03 |
TEMED | 0.008 | 0.006 | 0.004 | 0.004 | 0.004 | 0.003 |
l 在 1X 轉(zhuǎn)印緩沖液中預(yù)潤濕凝膠、Whatman 紙和海綿等材料。
l PVDF 膜應(yīng)在甲醇中孵育 10 秒。至 1 分鐘,然后移至 1X 轉(zhuǎn)移緩沖液。
l 將以下材料堆疊:外殼(黑色面)、海綿、Whatman 紙、凝膠、膜、Whatman 紙、海綿、外殼(透明面)。
l 將黑色面朝黑色放入轉(zhuǎn)印設(shè)備中。
l 在低溫環(huán)境中,使用轉(zhuǎn)印緩沖液進行轉(zhuǎn)印操作。轉(zhuǎn)印電流和時間可以根據(jù)實驗過程和使用說明進行優(yōu)化。
l 一抗在 1X TBST+3% BSA 中以推薦的稀釋度稀釋或根據(jù)結(jié)果優(yōu)化稀釋度。
l 在 4°C 下孵育過夜或更長時間,或在室溫下孵育 4 小時。
l 回收一抗并儲存在 4°C。然后在 RT 的振動篩上洗滌膜 3X 5-10 分鐘。
l 在 1X TBST 中稀釋二抗并將膜在室溫下孵育 1 小時或在振蕩器上在 4°C 下孵育 2-4 小時。
l 在 RT 的搖床上用 TBST 洗滌 3X 10 分鐘。
蘇州阿爾法生物所提供的天能系列SDS-PAGE 、蛋白電泳預(yù)制膠、梯度預(yù)制膠、電泳儀、電泳槽、核酸電泳預(yù)制膠、核酸電泳儀、電泳儀電源、電泳槽等實驗室設(shè)備。